3/27 分子生物学实验思考题

有一种想在这里更新思考题答案的冲动,要是有人帮我把答案附在评论里就更好了~

1 PCR扩增仪的热盖有什么作用?

You know when you use a heatblock with no lid and all your sample ends condensing in the lid of the tube? That's why they invented the heated lid. It will discourage your sample to evaporate and condensate on the lid, where the temperature is lower than what you wanted it to be. In the old days of PCR, when heated lids were not available yet, every 95oC cycle would cause evaporation and loss of sample, so after 25 cycles, you had nothing on the bottom of the tube. So they overlaid a droplet of mineral oil on the reaction, so that it wouldn't evaporate, then they had to extract the reaction without the oil, that was probably a big pain! Then a very smart person invented the heated lid, fixing everything.Use the heated lid, it won't hurt your reaction. It doesn't even need to be a high temperature, just high enough to discourage condensing.


2 模板是100个1000bp的质粒DNA分子,PCR反应时只加入一条特异引物(只有一个结合位置)进行扩增,延伸时间30s,30个循环后会得到什么样的产物以及产物数量?

首先假设这里用的是普通taq酶,最普通的那种,比如invitrogen的C10966.platinum.taq。这种酶按照说明书
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/china/C10966-Platinum-Taq-DNA-polymerase.pdf 延伸速度是1kb/min,30s显然不够整个plasmid的复制。

在这里分为两个情况,一方面要考虑只有一个,也就是物质的量为1/NA的引物

另一方面认为引物有一种:并且不考虑拓扑结构,给出两种极限结果,一种是有15000个负链线性dna,另一种是100个15000bp长的重复的线性dna(类似于lamda噬菌体的滚环复制),实际结果很有可能介于两者中间。

本题答案感谢黄总和嘉伟的支持。

#更正#在引物无限过量的情况下,产物无法和模板结合,会得到30000个500bp的负链dna。


3 引物与模板结合时遵循碱基配对原则。为什么是AT配对、CG配对?其它配对情况下有什么不妥?

双螺旋的两个碱基对应该有相同的几何结构,无论是at还是cg碱基对都不会影响两个糖的排列,因为这两个碱基对的糖附着点之间的距离总是相同的。两个糖之间有一个大致的对称轴关系,这样就不用扭曲dna 的总体结构,四个碱基对就能够安置于内,而且双螺旋的两条磷酸骨架上的碱基彼此可以整齐的堆积。因此dna中的碱基对顺序不规整,但是总体结构相对规整。其他的配对方式没有这种规整的结构。


4 我们都知道PCR的模板只能是DNA,但如果我就是要用RNA作为扩增模板,你认为可以吗?如果可以,需要在现有基础上做什么改变?最后再想一下,为什么即使理论上可行,人们仍然不会这么做?

这道题我还没想好。希望有人能告诉我原因。

另外这道题的用rna作为模板后扩增什么东西也是个问题……


5 为什么PCR反应叫做Polymerase chain reaction?

pcr反应是由dna polymerase催化的,chain代表链式反应,类似于原子弹爆炸的那个链式反应,以一种指数级的速度扩增原来的模板dna,所以叫这个名字。

3/27 分子生物学实验思考题》有4个想法

  1. 加一

    关于最四题的脑洞
    我猜一般不以RNA为模板进行扩增原因主要有二:RNA单链结构极不稳定,根本顶不住PCR什么九十多度的;还有就是空气里飘着的到处是RNA ,样品比较容易被污染
    要采取措施的话要在保持稳定性上下功夫吧我还没查
    然后即使可行人们仍然不会这么做我猜应该是RNA聚合酶没有校正功能,这玩意儿错误率太高辽。
    对的,都是我猜,全是废话。分子实验老师要是知道他的思考题催生了一个平台会不会很欣慰?
    算了他一高兴再来两题我就自闭了。

    1. 刘半仙儿

      1.有关rna热稳定性的问题,许多嗜热菌也应该是有rna的,这说明rna在较高温度下也能保持稳定
      2.普通的taq酶没有proofreading

发表评论

此站点使用Akismet来减少垃圾评论。了解我们如何处理您的评论数据