三月初六 分子实验思考题

看到只有两题的描述,挂科先锋刘半仙儿留下了没有数理基础的泪水。

亲爱的同学们,以下是这次课的思考题,总共只有两题
(一) 有同学使用我们实验课中的蛋白表达体系进行某种真核蛋白的表达,发现表达量非常低并且大多是包涵体形式。根据我们课上所学知识,他决定使用新的感受态细胞Rosetta-gami B(货号71135-3),你觉得他的选择正确吗?如果你觉得不正确,应该选择哪一种Rosetta-gami B(请标出货号)?
(二) 我们准备将目标基因构建到pET28(+)质粒载体上,载体图谱与目标基因的mRNA序列请见附件。①5’端的酶切位点我们选择Nco I,请给出你设计的引物序列。②如果我们不想在引物序列中引入新的碱基,能否通过选择某一特定pET28(+)质粒载体(a、b或者c)解决这一问题?③3’端的酶切位点我们选择Sac I,如果想在表达蛋白3‘端带有His标签,请给出你的引物序列。④如果我们仍然不想在引物序列中引入新的碱基,能否通过选择某一特定pET28(+)质粒载体(a、b或者c)解决这一问题?⑤如果我们就是不想在引物序列中引入新的碱基,将上下游的酶切位点更换为Hind III与Xho I,你认为可以吗?如果可以,应该使用哪一个质粒载体(a、b或者c)?

第七次课-转化BL21-只读

Competent Cell Host Strain Selection Guide

pET 28

目标基因的CDS序列

(一)

先来说明一个问题,包涵体是个什么玩意儿。

于是我打开了Wikipedia:

包涵体inclusion bodies),或包含体,是无定形的蛋白质的聚集,被膜所包围。细胞破碎后,包涵体呈颗粒状,致密,低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中,在变性剂溶液(如盐酸胍)中才能溶解。在这些溶液中,溶解的蛋白质呈变性状态,即所有的氢键疏水键全被破坏,疏水侧链完全暴露,但一级结构共价键不被破坏。因此当除去变性剂时,一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型,这一折叠过程称为蛋白质的复性。

包涵体主要由蛋白质构成,其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此,欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包涵体后,溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以,包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度,也为生物化学家的蛋白质折叠(protein folding)机理研究提出了新的课题。

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径,开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是,人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难,很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物(如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素-6、人γ-干扰素等)不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒-包涵体(inclusion bodies IBs)。

我猜测八成他这个选择是要凉的。我们先看一看这个Rosetta-gami B是个什么东西。参考文献是Novagen公司的说明书,提到了rosetta technology——the first bacterial bost system to offer universal translation,by supplementing 6 rare trnas in one strain.看起来rosetta technology是为了解决Ecoli密码子偏好性的一个解决方案。对于rosetta gamiB,文中指出:

Rosetta-gami B Competent Cells
• combine the advantages of Origami B and Rosetta strains in one host
• h a v e trxB/gor mutations for disulfide bond formation and improved
protein folding in vivo
• are derived from a lacZY mutant of BL21 to enable precise control
of expression levels by adjusting the concentration of IPTG
• include the lon and ompT deficiencies of BL21 which increase
protein stability

货号71135-3是没有DE3的版本,de3是整合在细菌基因组上一种携带了T7 rna polymerase的基因和lacI基因的lambda噬菌体基因片段,而pET系统的质粒显然是需要T7启动子的,所以我选择货号71136-3,另外两种含有lacI和LysS是为了降低毒蛋白表达量,我默认这题表达的不是什么毒蛋白。于是就这样了。

是我小看了张祺!

这个问题真的只有这么简单吗?并不是,只用ctrl+F搜索文档的恶果就体现出来了

Rosetta-gami B本身是Kan抗性的,而pet28系统用的是Kan进行筛选,所以……就不能用这个系列的菌。

(二)

第一题是设计引物,附件中高亮部分为CDS序列,CDS序列及coding sequence,由于进行原核表达,我们要从这里开始进行引物设计。然后发现序列中CDS序列有一个重复结构,为了避开它我们向5‘端继续添加序列。

CDS里面那个重复序列我真是哭了

这里要考虑的几个问题:1.对框问题 2. 酶切位点前的保护性碱基 3.tm值应该在一个合理区间 4.与序列本身应该有最少17bp的配对 5.hairpin和与dna 的second complementary。也许还有别的啥。

给出我的答案:

F:CATG CCATGG AC ATGGGCAAGAAGCAC

第二题不想引入新的碱基。似乎他的意思是在说不想要上面那个AC?然后把目的基因和NcoI做成overlap,我尝试着分析了一下这样设计的引物,一方面会出现3’末端的hairpin,另一方面会和dna有两种配对。而且既然要做一个引物序列还要做双酶切,要添加保护性碱基怎么可能不引入新的碱基呢?如果是为了对齐3‘端下游的his tag而不在R引物上添加碱基……倒是可以用pet28b。他到底想表达什么……请在评论中告诉我。

第三题很轻松。注意表达3‘His的对框问题,另外由于我们要表达histag,最后不能有终止密码子。

R: CC GAGCTC CC TGAAGGT GGTCCAG GTG TGAG(这是根据pet28a设计的引物)

第四题:可以选择pet28b

R: CC GAGCTC  TGAAGGT GGTCCAG GTG TGAG(这是根据pet28b的引物)

这两道题的答案是错误的,为什么呢?因为挂科先锋刘半仙儿在reverse序列后忘记了勾选show complementary sequence,这就导致我用来设计引物的序列是错误的……两个R引物的设计就都错了。

第五题:

不可以,HindIII会切断目的基因。不过如果找到一个跟hindIII有相同的黏性末端还不会切开目的基因的限制酶,abc好像都可以。

 

 

#附注:我今天脑子不太好用,请看到本文的同学double check一下引物设计。

#给附注的附注:最后也没有人double check我的引物设计,真是太惨了。

发表评论

此站点使用Akismet来减少垃圾评论。了解我们如何处理您的评论数据