分类目录归档:某硬核老师的思考题

三月初六 分子实验思考题

看到只有两题的描述,挂科先锋刘半仙儿留下了没有数理基础的泪水。

亲爱的同学们,以下是这次课的思考题,总共只有两题
(一) 有同学使用我们实验课中的蛋白表达体系进行某种真核蛋白的表达,发现表达量非常低并且大多是包涵体形式。根据我们课上所学知识,他决定使用新的感受态细胞Rosetta-gami B(货号71135-3),你觉得他的选择正确吗?如果你觉得不正确,应该选择哪一种Rosetta-gami B(请标出货号)?
(二) 我们准备将目标基因构建到pET28(+)质粒载体上,载体图谱与目标基因的mRNA序列请见附件。①5’端的酶切位点我们选择Nco I,请给出你设计的引物序列。②如果我们不想在引物序列中引入新的碱基,能否通过选择某一特定pET28(+)质粒载体(a、b或者c)解决这一问题?③3’端的酶切位点我们选择Sac I,如果想在表达蛋白3‘端带有His标签,请给出你的引物序列。④如果我们仍然不想在引物序列中引入新的碱基,能否通过选择某一特定pET28(+)质粒载体(a、b或者c)解决这一问题?⑤如果我们就是不想在引物序列中引入新的碱基,将上下游的酶切位点更换为Hind III与Xho I,你认为可以吗?如果可以,应该使用哪一个质粒载体(a、b或者c)?

第七次课-转化BL21-只读

Competent Cell Host Strain Selection Guide

pET 28

目标基因的CDS序列

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二月廿八 分子实验思考题

许多年以后,面对老板,刘半仙儿仍然能想起那个被思考题支配的下午。

(虽然现在是上午)
[expander_maker]
 

  1. 比较 菌落PCR 和 提质粒酶切 这两种方法的优缺点,为什么需要两次鉴定?
  2. 菌液PCR是阳性,但酶切只有一条带,原因可能是什么?
  3. 就目前大家已学到的鉴定重组子的方法而言,还是比较费时费力的。科研工作者们其实一直在探索更简便、高效的筛选方式。首先阅读1987年的那篇文献,告诉我它鉴定的原理与方式是什么,再阅读2007年那篇文献,你认为它与1987年那篇文献在原理上是否相同?在方法上有些什么差异

 

 

2007-A RAPID AND SIMPLE METHOD FOR SCREENING LARGE NUMBERS OF RECOMBINANT DNA CLONES.pdf

1987-A Rapid Screening Procedure for the Identification of Recombinant Bacterial Clones.doc

  1. 菌落PCR是一种比较方便快捷的鉴定方法,对本次六个样品,大概需要半小时配置pcr反应体系,pcr的过程是预置程序,再用半个小时到一个小时电泳鉴定。整个实验流程需要人参与的部分不到一个半小时。这种方案的缺点在于pcr的灵敏性很高,如果没有挑取单菌落或者在配制反应体系时发生污染,很可能出现假阳性。酶切从精确性上更胜一筹。但是需要一个小时先提质粒,一个小时酶切,再用一个到半个小时进行电泳检测,一方面比较麻烦费时,另一方面成本比较高:纯化柱和酶都很贵。如果做了酶切鉴定没必要做pcr鉴定,两次鉴定一方面是为了教学,另一方面是为了确保得到了重组克隆

  2. pcr结果可能是假阳性,比如没有挑取单菌落或者pcr的反应体系受到了污染。

  3. 好吧这两个标题党……

    87年的那位先用溶菌酶制备原生质体,然后把这些原生质体点到有裂解液的胶孔中。根据重组质粒和普通质粒的不同大小进行区分。

    07年中山大学的这些人就更简单了,他们直接用了普通质粒抽提试剂盒溶液二(或者那个配方吧)对E.coli进行碱裂解,离心后去上清加loading去跑电泳。

    原理上都是一样的,把细菌破碎掉根据重组质粒长一些用电泳分开。

说一些题外话……1979年就有碱裂解法了,1987年的老哥还费了这么大的劲,直到07年人们才想起来用溶液二?

也许有人觉得这东西不值得发篇文章?

Reference:

Birnboim HC, Doly J (November 1979). “A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA”. Nucleic Acids Res. 7 (6): 1513–23.doi:10.1093/nar/7.6.1513. PMC 342324. PMID 388356.

以及上面附件里的两篇文献。

3/27 分子生物学实验思考题

有一种想在这里更新思考题答案的冲动,要是有人帮我把答案附在评论里就更好了~

1 PCR扩增仪的热盖有什么作用?

You know when you use a heatblock with no lid and all your sample ends condensing in the lid of the tube? That's why they invented the heated lid. It will discourage your sample to evaporate and condensate on the lid, where the temperature is lower than what you wanted it to be. In the old days of PCR, when heated lids were not available yet, every 95oC cycle would cause evaporation and loss of sample, so after 25 cycles, you had nothing on the bottom of the tube. So they overlaid a droplet of mineral oil on the reaction, so that it wouldn't evaporate, then they had to extract the reaction without the oil, that was probably a big pain! Then a very smart person invented the heated lid, fixing everything.Use the heated lid, it won't hurt your reaction. It doesn't even need to be a high temperature, just high enough to discourage condensing.

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