作者归档:skelviper

铁板米饭

610在他的博客首页上写:

人总是会把自己的生活活成笑话中的样子

深以为然。
现在媒体这么发达,天天在网上转来转去看到各种笑话,啊这些人怎么这么可笑。然后突然有一天发现自己过得跟他们一个样子
吃乎这件事情说起来是这样的,学校有个社团开了个公众号叫做吃乎,最近发了一份食堂测评:

桂园一楼铁板牛肉饭,准确的说是“黑椒牛柳饭”,所谓不加酱料,指的便是那个黑椒酱。刚读大一头一次来桂圆小食吃饭,点的也是这一款,应该来说当时的感觉远远比现在来的复杂得多:

  • 医学部食堂真tm难吃,这个水平有所提高。
  • 铁板有点意思,很有分量。但是铁板外围和木质底托以及铁盘上的油,就让我有一种你不知道怎么洗盘子的怀疑。(当然也可能是知道但是不好好洗
  • 这年头盐怎么又不要钱了,福岛事故屯的盐现在还没吃完去库存吗?

总之从那以后我就再没光顾过这个窗口。
不过看到这个测评让我萌生了按照这个方案再尝尝的念头,你看,满满半个盘子的肉,定制的吃法似乎能让它不是那么咸,这么久不去,之前又闹军运会,也许卫生条件也有不错的改观不是?打分到了满分哎,整个推文里这个的评分最高,相比应该不会踩坑吧~

↑卖家秀


买家秀↓

你看,这谁能想到会变成这个样子,星星点点几片肉薄如蝉翼,夹生的米饭,连青菜都这么少。
值得肯定的是,不加酱少加盐滤掉油之后,确实从难以下咽进步到了可以下咽,但你要说给他打个五星?
值得商榷,值得商榷。

从病毒到质粒:DNA是怎么进入细胞核的

从病毒到质粒:DNA是怎么进入细胞核的

背景

DNA病毒(包括Baltimore分类法Class I、II、VII)中的绝大多数都需要让病毒的基因组DNA进入细胞核以完成病毒的复制,在这个问题上各种病毒可以说是“八仙过海各显神通”,其中的机制多种多样。由此引申出来另外一个十分有趣的问题。我们知道基因的转录一般都是在细胞核中(线粒体、叶绿体除外),而核孔具有高度的选择透过性。在我们经常做的转染实验中,质粒DNA经由各种转染试剂进入细胞后如果要表达基因,必须进入细胞核,这个过程又是怎么实现的呢?是否与病毒的基因组进入细胞核有相似性呢?

我们知道RNA出核蛋白质入核都是通过核孔复合体,自然的我们猜想病毒的基因组是否能通过核孔复合体进入细胞核。杆状病毒基因组大小可以到100kb左右,这么大的分子是很难直接像小分子一样自由扩散通过核孔复合体。在查资料之前,做一些猜测也无伤大雅:
+ 病毒基因组并不是一团,没有那么大,它可以直接通过核孔复合体(我个人难以置信这一点)
+ 病毒基因组被切断成小的片段(类似于流感病毒的Segmented genome)
+ 病毒DNA有自己的定位信号(类似于蛋白质的核定位信号)可以和importin相互作用帮助其进入细胞核。联系到我们可以直接转染质粒进入细胞进行表达,这似乎很合理。
+ 病毒DNA上的结合蛋白有核定位信号,和importin相互作用将其一共运进细胞核。
+ 能否干脆和NPC没关系?比如说在有丝分裂中核膜崩解再重新

要澄清几个概念(基本上就是我之前的误解):
+ 线粒体DNA是可以进入细胞核的,这不但包括在长期进化过程中mtDNA向细胞核内的转移,一些研究

怎么做实验研究病毒DNA如何入核

  • Xenopus oocyte nuclear import assay
  • in vitro nuclear import assay with digitonin-permeabilized cells
    听着这俩名字我不是很感兴趣,回头再说
    真香:
    第一种方法是通过显微注射的方法把病毒或者病毒的蛋白/核衣壳注射到细胞质里,然后再电子显微镜下观察。
    第二种方法是用去垢剂(也就是洋地黄毒苷,digitonin)将细胞膜裂解,保留核膜。之后通过免疫荧光等方法观察。(先遮过去,具体过程我没搞懂。)

核孔/蛋白入核基本原理

几种病毒的入核机制

Enveloped

Hepatitis B

乙肝病毒的包膜经过网格蛋白内吞,释放出内部核衣壳进入细胞,通过微管辅助运动进入到达细胞核附近。衣壳蛋白(core protein)在其富含Arg的C末端有两个经典的核定为信号。到达细胞核附近后core protein 发生磷酸化,暴露出其NLS,之后在Importin-α/β的介导下通过核孔,衣壳蛋白和Nup153结合,通过某种方式解聚释放出病毒的核酸进入细胞核。

Herpes Simplex Virus 1

HSV1的衣壳通过和Nup358结合,以Importin-β和Ran依赖的方式,形成固定的方向。基因组DNA通过衣壳上的出口被释放,通过核孔进入细胞核,而空的衣壳被保留在细胞质一侧。

Baculoviruses

杆状病毒的核衣壳可以完整的进入细胞核。但是具体机制尚不清楚。

Non-enveloped

不同于包膜病毒,非包膜病毒面临的第一个问题其实是
非包膜的把病毒进入宿主主要通过胞吞的方式。在细胞生物学课程中我们知道,防御是溶酶体的重要功能。这些病毒必须要有某种方式逃脱宿主细胞的溶酶体。在腺病毒和细小病毒中,他们的衣壳在胞内体的酸性环境中会发生解聚,引起胞内体膜的解聚,并将病毒释放到细胞质中。SV40则直接进入内质网,再从内质网进入细胞质或者细胞核。HPV能耐就大一些,它可以一方面和腺病毒和细小病毒这样借助酸性胞内体的环境将病毒释放到细胞质中,另一方面可以通过先进入高尔基体这样的方式来躲避溶酶体。
接下来我们分别介绍一下这几种病毒的入核机制。

Adenovirus

腺病毒是最大最复杂的病毒之一,有36kbp长的双链DNA,编码了四十多个蛋白质,但是在病毒颗粒里只有13种蛋白质。腺病毒的一个独特特征是存在从衣壳的12个顶点伸出的纤维。对于细胞进入,这些纤维末端的结点附着在宿主细胞质膜上的细胞受体上。紧接着是网格蛋白介导的病毒内吞作用,并通过衣壳内部发现的蛋白VI的裂解活性从内体逃逸。在细胞摄取期间,纤维从衣壳中解离,其在核内体和内体逸出过程中进一步分解。在被释放到细胞质中后,部分分解的衣壳沿着微管运输到核外围,在那里它们停靠在NPC上。衣壳与NPC的结合导致衣壳的完全解体和随后病毒基因组的核导入。

Parvoviruses

细小病毒的衣壳直径大概是18~16nm, 和杆状病毒21nm(以AcMNPV为例)的直径相比,似乎很容易通过主动运输的方式通过核孔复合物进入细胞核。但是很多研究表明细小病毒进入细胞核并不通过核孔复合物。细小病毒破坏核膜并分解核层,从而进入核内。破坏核膜的机制尚未研究清楚。而分解核纤层则涉及通过PKC和cdk2来使lamin A / C磷酸化,并通过caspase-3切割lamin-B。

SV40

SV40在内质网(ER)内部部分分解,亚病毒颗粒可能遵循两种不同的途径将基因组传递到细胞核中。 第一种方法是使用细胞ERAD途径和细胞伴侣将亚病毒颗粒排入细胞质,在NPC处解体,并通过NPC导入未包被的基因组。 第二个是使用caspase-6直接破坏内核膜和下面的核层,直接从ER到核。

HPV

HPV会在内体中部分分解,并可能通过高尔基体进行分解,并在有丝分裂的核膜崩解过程中进入细胞核。

质粒的入核机制

终于开始到了有趣的部分。我们已经见识到了八仙过海的病毒们(特别的我就真的举了八个病毒的例子)
细胞转染是非常常见的实验,在真核细胞中完成高效的转染并表达蛋白需要让外源DNA通过细胞膜,通过细胞质,跨过核膜,转录,翻译,翻译后的修饰和蛋白定位等一些列过程才能得到我们想要的实验结果。在转染转染实验如何提高蛋白表达效率的方面,我们更多的关注点往往在于通过什么样的方法让质粒DNA跨过细胞膜进入细胞质,而对质粒入核的关注度则往往没有那么高。但是这个过程也十分重要。裸露的DNA在Hela细胞的细胞质中半衰期只有50~90min。当然需要注意的是当质粒DNA进入细胞质后“裸露”这个词语似乎不太恰当,因为质粒DNA很快会被细胞中的各种蛋白包裹起来形成DNA-蛋白复合物。这些蛋白质的存在压缩了质粒的体积,并防止DNA很快的被核酸酶分解。一个借助pEGFPN1(CloneThech)的研究表明多于600种蛋白被发现和质粒DNA相互作用,在运送质粒入核的过程中形成了一个动态机制,不断有心的蛋白质结合旧的蛋白质脱下。这里强调运送的概念是因为,质粒DNA是被主动往细胞核方向运送而不是通过一种自由扩散的形式。大于2000bp的质粒就很难在细胞质中随意扩散,更不要说我们的载体5、6kb是很正常的。
目前已经有研究证实质粒在细胞质中的运输借助微管网络和马达蛋白等,用诺考达唑(微管抑制剂)处理会大大减少报告基因的表达。但是DNA如何和微管发生作用则是一个非常复杂的过程,三言两语解释不清楚,所以在这里略过。这篇文章的另一个发现是即使是不分裂的细胞也会有报告基因的表达,所以质粒入核的途径并不全部是像HPV趁着核膜崩解进入细胞核。当然我们在这里也不能否认部分质粒在核膜崩解过程中进入细胞核的可能性。
To be continue……

一点牢骚话

转念一想:

牢骚太盛防肠断,风物长宜放眼量。
莫道昆明池水浅,观鱼胜过富春江。

所以我不写了。
让它们烂在那里,过几天就忘了。